來源：轉載大品種聯(lián)盟公眾號 | 發(fā)表時間：2021-08-30
劉長征，姜曉琳，蔡啟忠，楊全，周良云通訊作者
廣東藥科大學中藥學院/國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產與開發(fā)重點研究室/國家中藥材產業(yè)技術體系廣州綜合試驗站/廣東省南藥規(guī)范化種植與綜合開發(fā)工程技術研究中心，廣東廣州 510006
碳循環(huán)是生態(tài)系統(tǒng)中重要的生物地球化學元素循環(huán)之一，微生物參與了其中多個重要的循環(huán)過程。了解微生物在碳循環(huán)過程中的具體作用，有助于揭示微生物對環(huán)境變化的響應機制。磷脂脂肪酸(PLFA)作為微生物的標志物已被世界各地的學者廣泛應用到微生物的定性、定量研究中。但是單純的PLFA法并不能揭示特定微生物的代謝過程，無法研究特定微生物的功能。結合13C的PLFA法可以揭示微生物參與的碳循環(huán)過程，因此，可用于解決這一問題。隨著質譜等相關技術的日趨成熟，13C標記的PLFA法已成為研究微生物群落功能的一種常用方法。本文通過梳理大量文獻，綜述13C標記的PLFA法在微生物介導的植物-土壤碳循環(huán)和某些特定微生物上的應用，并在此基礎上進行展望，以期為中藥生態(tài)種植的研究提供參考。
PLFA是構成活體細胞膜的重要組分，在自然生長狀態(tài)下相對穩(wěn)定，不同類群的微生物能通過不同生化途徑形成不同的PLFA，部分PLFA總是出現(xiàn)在同一類群的微生物中，而在其他類群的微生物中很少出現(xiàn)。由于磷脂不能作為細胞的貯存物質，一旦生物細胞死亡，其中的磷脂化合物就會迅速分解，在細胞外環(huán)境中的PLFA量少且不穩(wěn)定，因此，PLFA可以作為活體微生物的標記物，用于研究微生物的種類和數(shù)量。
20世紀70年代，White等開始用PLFA法對河口沉積物中的微生物進行分析。此后，國內外學者逐漸利用此法對河海沉積物、土壤、發(fā)酵物中的微生物進行定性或定量分析。20世紀80年代，Boschker等提出通過添加13C標記的生物標志物與PLFA法相結合的方法，將微生物種群與特定的生物化學過程聯(lián)系起來。原則上，所有涉及生物吸收和消耗碳的過程都可以通過添加標記物的方法進行研究。將穩(wěn)定同位素標記與PLFA法2種方法相結合，對研究土壤中特定有機質循環(huán)有著極為重要的意義。
13C標記的PLFA法原理
將同位素標記后的物質添加到特定環(huán)境中，可以被微生物直接或間接吸收，然后在體內轉化為可被檢測的PLFA。對含有添加同位素的PLFA進行檢測分析，可以得到參與代謝添加物質的微生物信息。目前，最為常用的同位素標記方法是13C標記法，13C作為穩(wěn)定同位素其靈敏度高且無放射性危害。碳作為有機生命的主要構成元素，直接參與到所有生物的代謝活動中，因此，13C標記法還具有普遍適應性，這使得13C標記的PLFA法安全、有效且適用范圍較廣。13C標記的PLFA法可以將特定微生物與其功能聯(lián)系起來，提供有關微生物間相互作用及其代謝功能的直接信息，并且操作簡便、實驗成本低，因此，該技術已被廣泛應用于確認土壤微生物的生態(tài)功能、追蹤碳元素在微生物群體和個體間的流動等方面的研究中。
3.1 參與植物-土壤碳循環(huán)的微生物研究
3.1.1 植物殘體的微生物分解研究植物殘體是土壤有機質形成的主要母質，植物殘體的分解是全球碳循環(huán)中的關鍵一步，并且可以為土壤微生物的生命活動提供物質和能量。土壤微生物在植物殘體的分解中具有不可替代的作用，因此，可以通過研究土壤微生物來了解植物殘體的分解過程。Williams等在土壤中分別添加被13C標記過的絳車軸草Trifolium incarnatum L.和1年生多花黑麥草Lolium multiflorum Lam.的根及秸稈，并測量了土壤PLFA中的13C含量。發(fā)現(xiàn)4種處理中部分PLFA(16：1ω5和10Me17：0)中13C始終維持在很低的水平，而部分PLFA(16：0、18：1ω9和18：2ω6，9)總是含有較高比例的13C，研究表明，在土壤中存在的部分微生物負責同化殘留物。Pan等將13C標記的水稻秸稈及其衍生生物炭施用于水稻田中，研究其分解過程對土壤微生物群落結構和功能的影響。根據(jù)PLFA中13C數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，23種不同的PLFA參與分解水稻秸稈，而只有17種PLFA參與分解水稻秸稈衍生生物炭。此結論與Williams等的結論有一定的相似之處，并不是土壤中的所有微生物都參與了植物殘體的分解。
殘體的種類及土壤的種類、深度等性質均影響微生物對植物殘體的分解。Bai等在土壤中添加了3種13C標記的小麥殘體(麥粒、葉和根)，利用土壤中的PLFA來描繪微生物群落的動態(tài)變化。研究結果顯示，不同植物殘體產生的CO2和PLFA的量有顯著區(qū)別，其中麥粒最多，葉次之，根最少。Hicks Pries等在不同深度(15、55、95 cm)的土壤中添加13C標記的野燕麥Avena fatua L.根，發(fā)現(xiàn)30個月時，殘體在15 cm的分解速度比95 cm的快。Arcand等探討長期有機管理和常規(guī)管理是否會導致微生物在小麥殘渣分解上產生差異，結果發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)土壤相比，有機管理土壤中真菌尤其是放線菌在小麥殘渣分解上發(fā)揮更重要的作用。仇存璞等也證實，土壤原有有機質可以對參與秸稈分解微生物的群落結構產生影響。
3.1.2 參與土壤激發(fā)效應的微生物研究激發(fā)效應是由于相對溫和的土壤處理引起的土壤有機質周轉率的強烈短期變化，這些處理措施包括施肥、根系滲出有機物質、對土壤機械處理、土壤的干燥和再濕潤等。土壤微生物對外源有機質輸入的響應是形成激發(fā)效應的內在驅動力，可以通過研究土壤微生物來認識土壤激發(fā)效應。Nottingham等在土壤中添加13C標記的蔗糖和玉米Zea mays L.秸稈，由PLFA(16：1ω5和16：1ω7)鑒定的某些革蘭陰性細菌，在蔗糖和玉米處理中都表現(xiàn)出對土壤碳的吸收增加，并且可能與啟動效應直接相關。Wang等將13C標記的新鮮玉米葉和莖添加到土壤中，研究新鮮有機質質量的變化對土壤激發(fā)效應的影響。發(fā)現(xiàn)與添加莖的土壤相比，添加葉片的土壤中微生物生長更快，但是16 d后則相反。并且認為，微生物對碳和其他營養(yǎng)物質的需求是土壤激發(fā)效應的主要決定因素之一。Qiao等借助13C標記的PLFA法發(fā)現(xiàn)，真菌在幼林土壤的啟動效應中具有重要作用。
除了向土壤中添加植物殘體可以引起土壤激發(fā)效應外，植物本身也會引起激發(fā)效應。植物根系參與的土壤有機質分解的變化，稱為根際激發(fā)效應(RPE)。Bird等在1項為期2年的溫室研究中，在種植裂稃燕麥Avena barbata Pott ex Link和非種植條件下，用13C標記的地下碳(根系和有機質)。實驗發(fā)現(xiàn)，與未種植的土壤相比，活根增加了地下13C的周轉率和損失，并且其中的革蘭陽性菌對地下13C的長期利用得到了增強。因此認為，革蘭陽性菌的活性可能是激發(fā)作用主要調控因子。Kou等采用天然13C示蹤劑對大豆和棉籽木3個生長期的RPE進行定量分析，使用PLFA測定土壤微生物和線蟲的群落組成，并探討其與RPE的關系。結果發(fā)現(xiàn)，不同生長期RPE差異較大，大豆產生的累積RPE>棉籽木，大豆處理組發(fā)現(xiàn)的細菌PLFA值較高，也表現(xiàn)出植物種類效應。分析結果表明，微生物群落的變化與RPE、土壤和植物特性密切相關，線蟲群落通過改變微生物群落結構間接影響RPE。因此，根際土壤微食物網(wǎng)的相互作用可以調節(jié)微生物的周轉或微生物群落的組成，從而調節(jié)RPE。
3.1.3 促進根際碳循環(huán)的叢枝菌根(AM)真菌研究 AM是陸生高等植物的根部與真菌菌絲所形成的一種結合體，是一種共生現(xiàn)象。AM真菌在根部定植后，寄主植物發(fā)生了深刻的生理變化，不僅可以促進寄主植物從土壤中吸收礦質元素和水分，還可以把植物中的碳傳輸?shù)酵寥乐?，并調節(jié)土壤有機質的分解。Paterson等用13CO2脈沖標記黑麥草，采用不同孔徑的網(wǎng)格控制根系和叢枝菌根菌絲進入土壤，并定量PLFA和土壤釋放CO2中的13C。證明了叢枝菌根除影響凋落物分解速率外，對原生土壤有機質的轉化也有重要影響。Herman等在種植長葉車前Plantago lanceolata L.的土壤中添加13C標記的長葉車前的根凋落物，研究AM真菌對凋落物分解的調節(jié)作用。結果顯示，根凋落物在分解時，含有AM真菌的組中，革蘭陰性菌、革蘭陽性菌和AM真菌(16：1ω5c)對13C的富集程度低于不含AM真菌的處理組。這種富集現(xiàn)象可能是由AM真菌將植物中的13C提供到土壤微生物群落中產生，因此，這種碳輸入具有可以改變凋落物分解的中介作用。
但是AM的作用會受到外來物種、水分條件等影響。Dierks等在研究旱雀麥Bromus tectorum L.入侵對蒿屬植物草原AM真菌群落結構的影響時，用13CO2脈沖標記蒿屬植物，并通過含13C的PLFA來評估土壤微生物。發(fā)現(xiàn)旱雀麥的入侵能改變AM真菌的群落結構，降低了AM真菌的豐富度。Bao等利用13CO2標記并計算水稻在不同淹水條件下向AM真菌轉移的碳量。結果表明，在所有淹水條件下，均有植物同化碳轉移給AM真菌，AM真菌PLFA中13C顯著富集，但是隨著淹水強度的增加，AM真菌中的碳轉移量呈下降趨勢。此外還發(fā)現(xiàn)，土壤中原生動物、不同樹種、土壤氮含量均對AM的作用產生不同程度的影響。
3.1.4 光合作用產物的微生物利用研究植物通過光合作用固定大氣CO2，生成的部分有機物，并可以通過根部釋放到土壤中。土壤中的微生物則會對這部分有機物進行分解利用，除了滿足自身發(fā)育需要，還將部分有機碳以CO2的形式釋放到大氣中。因此，研究光合作用產物的微生物利用過程對于認識全球碳循環(huán)具有重要意義。Butler等最早將13C標記PLFA法應用到植物光合作用產物的根際微生物利用研究中，并且證明了該方法的可行性。此后大量學者使用類似的方法研究光合作用產物在土壤中的循環(huán)，其中多數(shù)學者采用13CO2脈沖或連續(xù)標記，相關研究則借助C3植物和C4植物在光合作用中對13C同化量的差異來達到標記效果。
Chaudhary等采用13CO2脈沖標記柳枝稷Panicum virgatum L.，并分析根際土壤中PLFA與根際沉積碳的結合情況。實驗發(fā)現(xiàn)，真菌和革蘭陰性菌PLFA中的13C富集速度快于革蘭陽性和放線菌，但是放線菌PLFA中13C的比例隨采樣時間的增加而顯著增加。Yuan等在水稻的不同生長期進行13CO2脈沖標記，并分析了水稻根際土壤中的PLFA，發(fā)現(xiàn)根際土壤中真菌PLFA中13C的比例最高，放線菌PLFA的13C則是最小的。此外，還發(fā)現(xiàn)干旱、植物種類、物種多樣性、施肥均會對微生物對光合作用產物的分解利用產生不同程度的影響?？赡苁怯绊懸蜃拥淖兓紫扔绊懙街参镝尫诺酵寥乐杏袡C物的性質和數(shù)量，繼而影響微生物對有機物的利用過程，或者是影響因子的變化直接影響到了土壤中微生物的組成。
3.2 特定微生物研究
3.2.1 甲烷氧化菌甲烷(CH4)是一種僅次于CO2的溫室氣體，且其溫室效應能力遠高于CO2。土壤中甲烷氧化菌對CH4的氧化消耗是大氣CH4唯一的生物匯，甲烷氧化菌對于維持大氣中CH4的濃度、降低溫室效應有較為重要的意義。因此，學者利用13C標記的PLFA法來研究了甲烷氧化菌對CH4的氧化作用。Zigah等利用13C標記的PLFA法分析了基伍湖水柱中CH4氧化途徑和相關的甲烷氧化菌群落。實驗證明，湖水中CH4的主要氧化途徑是Ⅱ型甲烷氧化菌介導的好氧氧化。一種新型的厭氧甲烷氧化古菌(ANME)而不是已知的ANME-1和ANME-2參與了CH4的厭氧氧化。Henneberger等研究了垃圾填埋場覆蓋土壤中活躍的甲烷氧化菌在空間和季節(jié)上的差異。實驗發(fā)現(xiàn)，在活躍的甲烷氧化菌群體中表現(xiàn)出明顯的空間和季節(jié)差異，并且發(fā)現(xiàn)Ⅰ型甲烷氧化菌特別是甲基單胞菌和甲狀桿菌是CH4的主要氧化菌群。Crossman等從垃圾填埋場取得的富含甲烷氧化菌的黏土和沙土，然后用13C標記的CH4進行孵育。PLFA分析后得知，黏土中甲烷氧化細菌群落隨深度變化而變化，而沙土在整個深度都表現(xiàn)出Ⅰ型和Ⅱ型甲烷氧化菌混合?？赡苁巧惩镣笟庑暂^高，使得CH4可以滲透土壤，而黏土則限制了CH4的滲透。植物可以通過改變土壤微生物群落結構來改變土壤功能。Menyailo等研究了不同樹種對于土壤甲烷氧化菌的影響，發(fā)現(xiàn)樹種改變了大氣CH4氧化活性，但沒有改變甲烷氧化菌的組成。Tate等則指出植被、土壤質地和充水孔隙空間都會影響甲烷氧化菌對CH4的氧化，且影響這些特定生態(tài)系統(tǒng)中CH4吸收的似乎是多種因素的組合，而不是單個因素。
3.2.2 浮游植物浮游植物廣泛分布于江河湖海中，是全球生物碳、氮、氧、硅、磷和鐵的循環(huán)中心，是水體生態(tài)系統(tǒng)中最重要的初級生產者。浮游植物作為水體其他生物的直接或間接的食物來源，是維持水體生物多樣性的重要物質基礎。浮游植物是水體溶氧的主要提供者，在維持大氣中CO2的濃度上具有無法替代的位置。同時，浮游植物對環(huán)境變化較為敏感，因此，其種類組成與優(yōu)勢種類群等數(shù)據(jù)可以用來監(jiān)測水體環(huán)境。13C標記的PLFA法可以用來估算特定浮游植物的產量，也可以用以研究“浮游植物-細菌”食物鏈。Dijkman等發(fā)現(xiàn)，在藻類培養(yǎng)中，以13C標記的PLFA為基礎計算生長速度，以生物量增加為基礎計算生長速度時，PLFA濃度和細胞數(shù)上呈現(xiàn)一致性。證明可以通過藻類的PLFA來估算特異性初級產物產量。同樣是在斯凱爾特河中，Boschker等對河流春季繁殖期浮游生物群落結構和同位素組成進行研究，發(fā)現(xiàn)在河流下游的近海一側，細菌和藻類PLFA中的同位素比值相似，表明藻類生產與有機物的細菌消耗之間存在耦合關系。然而在河流上游，與藻類PLFA相比，細菌PLFA的中13C值較高，表明該河流存在一個非耦合的藻類-細菌系統(tǒng)，并有陸源有機質或污水等支持細菌生長，并非藻類可以完全支持細菌的生長。De Kluijver等研究CO2濃度上升對浮游植物向細菌轉移碳的潛在影響。在不同CO2濃度下培養(yǎng)浮游植物，用含13C碳酸氫鹽進行標記。利用PLFA的同位素比值來推斷浮游植物和細菌的生物量和產量，發(fā)現(xiàn)CO2濃度升高對綠藻、硅藻和細菌的生物量有顯著的正向影響，但是對浮游植物向細菌的碳轉移效率沒有顯著影響。
在中藥生態(tài)種植研究領域的展望
藥用植物與其根際微生物聯(lián)系密切，根際微生物對藥用植物的生長發(fā)育、產量、次生代謝產物的積累等均具有重要影響，開展藥用植物與其根際微生物的互作研究對于中藥材產業(yè)的發(fā)展具有指導意義。PLFA法也已經(jīng)被應用到藥用植物的根際微生物研究中。李建鵑等利用PLFA技術研究連作木麻黃根際土壤微生物，發(fā)現(xiàn)隨栽培代數(shù)增加，細菌含量減少，真菌含量增加。鄒立思等也利用PLFA技術研究4個產地太子參的根際土壤微生物，發(fā)現(xiàn)4個產地太子參的PLFA在種類和組成比例上存在很大的差異。目前，中藥對于PLFA法在中藥中的應用范圍較窄，一般只是對中藥材根際土壤的PLFA進行種類和數(shù)量上的差異性比較，并沒有利用13C標記的PLFA法進行研究的案例。13C標記的PLFA法作為一種成熟的研究微生物動態(tài)變化的技術，在確認藥用植物根際微生物的功能、篩選有益微生物、揭示藥用植物-土壤-微生物關系上具有較大的優(yōu)勢，因此，在中藥生態(tài)種植研究領域具有廣闊的前景。
4.1 篩選增加藥用植物抗性的AM真菌
AM作為分布廣泛的植物與真菌共生體，其對植物的保護功能一直是研究的熱點?，F(xiàn)代研究表明，AM真菌可以促進宿主植物對于氮、磷等元素的吸收，提高宿主植物的耐旱、耐鹽、耐重金屬的能力。在中藥材農業(yè)生產上，AM真菌可以通過增加藥用植物的抗性來提高藥材產量和質量。
AM為植物和土壤之間的物質橋梁，連通著寄生植物和土壤微生物。使用13C標記的PLFA法可以追蹤碳從宿主植物到AM真菌，再到土壤微生物的過程，并且計算出碳的轉移量，能從微生物層面上揭示植物、AM和土壤微生物之間的關系。因此，13C標記的PLFA法在中藥種植方面為篩選提高藥用植物抗逆性的AM真菌，提高AM侵染率提供理論依據(jù)。以期通過添加有益AM真菌增加藥用植物抗性，達到減肥減藥、提高植物成活率、實現(xiàn)經(jīng)濟效益和生態(tài)效益的雙贏的目的。
4.2 篩選緩解藥用植物連作障礙的微生物
根和根莖類藥材約占藥用植物的70%，且絕大數(shù)根和根莖類藥材存在連作障礙。藥用植物連作障礙可以降低種子發(fā)芽率，增加土傳病害發(fā)生率，降低中藥材產量和品質，阻礙中藥產業(yè)的健康發(fā)展。周芳等認為，植物-土壤-微生物共同作用引起藥用植物連作障礙，但三者之間的內在影響機制還不夠明確。根據(jù)藥用植物特點開發(fā)新的微生物制劑來緩解藥用植物連作障礙，對于提高藥用植物產量和質量具有重要意義。
使用13CO2對藥用植物進行脈沖標記或者連續(xù)標記，并通過含13C的PLFA定位可以利用根系分泌物的土壤微生物或直接向土壤中添加13C標記的已知自毒物質，分析根際微生物的變化，找到參與代謝自毒物質的土壤微生物并通過進一步實驗檢驗該部分微生物緩解植物連作障礙的能力。因此，13C標記的PLFA法可以為篩選有益生防菌來緩解藥用植物連作障礙提供數(shù)據(jù)支持。
4.3 非藥用部位堆肥還田評價
藥用植物收獲后的非藥用部位一直是以丟棄為主，浪費資源，若處理不當還可能造成環(huán)境污染，影響人類健康。而將非藥用部位堆肥還田處理，很好地解決了藥用植物非藥用部位隨意丟棄的問題，也減少了化肥的使用，實現(xiàn)資源的循環(huán)利用，符合中藥生態(tài)種植理念。
使用13C標記生長期的藥用植物，并在收獲后將非藥用部位進行堆肥實驗?？梢酝ㄟ^13C 標記的PLFA找到參與腐熟的微生物群落，獲得不同腐熟階段優(yōu)勢菌種信息。堆肥施用后，還可通過13C標記的PLFA法檢測土壤微生物的變化情況。因此，13C標記的PLFA法可以用來研究堆肥腐熟進程，調控堆肥條件，并且根據(jù)對土壤微生物群落的影響情況來評價肥料的質量。
結語
綜上所述，13C標記的PLFA法在揭示微生物功能方面具有獨特的優(yōu)勢。藥用植物的種植與微生物息息相關，特別是藥用植物生態(tài)種植領域提倡以菌治病，菌根真菌等生態(tài)農業(yè)常用技術的使用，更加注重微生物在藥用植物種植中的應用。因此，使用13C標記的PLFA法揭示微生物與植物的關系，促進相關微生物技術在藥用植物生態(tài)種植領域的應用，有助于推動中藥產業(yè)的現(xiàn)代化發(fā)展。
